Enviro-Biotics® inhibition de l'infectivité du pseudovirus SARS-CoV2.
Enviro-Biotics® inhibition de l’infectivité du pseudovirus SARS-CoV2.
Francesco Piacente1, Laura Sturla1, Mirko Magnone1, Katia Cortese2, Cristina Gagliani2, Moti Rebhun3, Hila Weissman3, Rotem Link3, Martin H. Bluth3,4,5
- Section ME.S. de biochimie, Université de Gênes, 16132 Gênes ; Italie
- ME.S. section d’anatomie humaine, Université de Gênes, 16132 Gênes, Italie.
- Département de pathologie, Maimonides Medical Center, Brooklyn, NY, États-Unis
- École de médecine de l’Université Wayne State, Detroit MI, États-Unis.
*Correspondance à : Martin H. Bluth, MD, PhD Professeur de pathologie
École de médecine de l’Université Wayne Statetoxdocs@gmail.com
Abstrait
La pandémie de covid-19 a affecté le monde de diverses manières négatives. Alors que la vaccination, la thérapeutique et la distanciation sociale sont essentielles pour contrôler la propagation virale, les approches de désinfection antivirale restent moins efficaces en raison des réponses cutanées caustiques de certains agents chimiques, des exigences d’application répétitives, en plus des réalités de couverture de surface inefficaces et des coûts de consommables, de stockage et de manutention.
L’efficacité récente d’Enviro-Biotics® démontre un changement de paradigme dans le contrôle des organismes infectieux dans l’environnement. L’application d’Enviro-Biotics® à l’infection par le covid-19 peut s’avérer efficace pour réduire l’infectiosité virale. Afin de tester l’efficacité antivirale d’Enviro-Biotics®, deux constructions du virus pseudoCovid-19 ont été générées, exprimant la protéine Spike SARS-CoV2 S et en parallèle la protéine fluorescente verte (EGFP) ou l’enzyme luciférase (LUC). La présence de la protéine Spike S sur le pseudoCovid-19 produit dans HEK293T a été confirmée par analyse Western blot ; de plus, l’analyse par microscopie électronique à transmission sur les pseudovirus générés a confirmé que la taille des particules pseudovirales (131 nm) était similaire à celle du virus naturel SARS-CoV2.
Des cellules Caco-2 ont été infectées avec des pseudovirus et incubées en présence ou en l’absence d’Enviro-Biotics® contenant des spores de Bacillus et évaluées pour l’infectivité virale à différents moments. L’incubation des espèces de Bacillus contenues dans Enviro-Biotics® a diminué l’infectivité des constructions GFP et LUC pseudoCovid-19 (> 99 % après trois heures, p < 0,001). Des réductions similaires de l’infectiosité virale ont été observées après le traitement par Enviro-Biotics® via (1) une analyse par microscopie confocale de cellules Caco-2 fluorescentes incubées avec EGFP-pseudoCovid-19 et (2) une quantification du cristal violet après la formation de colonies induite par la puromycine.
En conclusion, les espèces de Bacillus contenues dans Enviro-Biotics® ont diminué l’infectivité virale d’un modèle de virus pseudoCovid-19. Cette approche fournit une modalité unique, peu coûteuse, efficace et durable pour réduire l’infection par le covid-19 et la transmission des maladies.
Introduction
La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), causée par un nouveau coronavirus, le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2), est la cause d’une pandémie qui a infecté plus de 180 millions de personnes dans le monde avec une mortalité de plus de 4 millions personnes [https://www.worldometers.info/coronavirus/]. Malgré les améliorations en matière de conduite, de diagnostic et de traitement en matière de santé publique, il est impératif d’optimiser toutes les ressources pour minimiser la propagation du virus. Alors que la distanciation sociale, le port de masques et le lavage des mains restent un élément de base de la conduite antivirale, la propagation virale se poursuit dans le monde entier. Bien qu’efficace, l’utilisation de masques faciaux présente des limites, notamment le type de masques portés (1), le maintien d’une bonne étanchéité oropharyngée (2), l’aggravation des difficultés respiratoires chroniques (3,4) et une utilisation efficace douteuse dans certaines populations telles que les enfants ( 5,6).
Outre les stratégies de vaccination, d’autres approches pour empêcher la transmission virale comprennent des applications antiseptiques, notamment l’alcool, les détergents, l’iode, l’hypochlorite de sodium (eau de Javel), le peroxyde d’hydrogène, le dioxyde de chlore, le glutaraldéhyde, l’irradiation ultraviolette et la purification de l’air (7,8). Cependant, les approches de décontamination utilisant des détergents nécessitent des cycles continus d’applications favorisant l’irritation ou la manifestation de maladies d’agents sélectionnés chez les personnes sensibles (9,10) et les coûts accrus qui en résultent liés aux matières dangereuses, à l’expédition, au stockage et aux exigences de réapplication fréquentes. De plus, le lavage constant des mains, en tant qu’élément de base de la pratique de réduction de la transmission antivirale, a été associé à une incidence accrue de dermatite de contact et d’autres affections dermatologiques (11,12). De toute évidence, il reste un besoin d’interventions alternatives.
Enviro-Biotics® représente un nouveau domaine émergent de probiotiques environnementaux où certains micro-organismes inoffensifs naturels tels que les espèces de Bacillus (c’est-à-dire B. subtilis, B. pumilus et B. megaterium) fournissent un microbiome pour l’environnement (13). Les Enviro-Biotics® sont capables de coloniser les surfaces sur lesquelles ils sont appliqués et d’exclure de manière compétitive d’autres organismes nuisibles en contrecarrant la prolifération et la survie de ces agents infectieux, fournissant ainsi un environnement équilibré et hygiéniquement stable (14). De plus, les Enviro-Biotics® sont dispensables par aérosolisation et sont capables de survivre et de coloniser des surfaces non biologiques. Cela offre une meilleure «couverture» contre les agents infectieux par rapport à la distribution conventionnelle de détergents à base de serviettes ou de tampons, qui peut être exclue dans les fissures et les surfaces inégales. Une telle administration peut offrir une longévité d’effet avec une consommation de produit minimale et un coût moindre.Enviro-Biotics® s’est avéré efficace pour assainir les environnements hospitaliers et fournir une alternative “verte” aux désinfectants chimiques courants. Des études antérieures ont montré les effets bénéfiques d’Enviro-Biotics® contre S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. faecalis, C. Difficile, A. baumannii et Albicans, en tant qu’organismes représentatifs responsables des infections nosocomiales (HAI) (14,15).
Ces études ont également montré que ces interventions Enviro-Biotics® étaient jusqu’à 80 % plus efficaces que les désinfectants chimiques conventionnels pour réduire les charges microbiennes potentiellement pathogènes. De plus, malgré le potentiel continu de recontamination des infections nosocomiales (IAS) (par les visiteurs, les patients, le personnel), la réduction observée de la charge microbienne a été maintenue de manière stable à de faibles niveaux après l’application (14).
Le rôle d’Enviro-Biotics® dans les maladies virales a également démontré des effets bénéfiques dans un modèle murin de virus respiratoire syncytial (16) en augmentant les molécules effectrices antivirales et que des peptidoglycanes (PG) spécifiques de Bacillus subtilis réduisent l’infection virale supérieure à 10 000- fois par rapport au PG d’autres espèces bactériennes (17).
Ici, nous avons évalué la capacité d’Enviro-Biotics® sur un analogue de Covid-19 à réduire l’infectiosité virale en tant que nouvelle intervention potentielle contre Covid-19.
MÉTHODES
Culture de cellules
Des cellules HEK293T (American Type Culture Collection, Rockville, MD, États-Unis) ont été cultivées dans du milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Merck, Milan, Italie) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (Merck), de L-glutamine 2 mM et de 1 % de pénicilline/ solution de streptomycine (Merck) à 5% de CO2 et 37°C.
Des cellules Caco-2 (usine cellulaire, hôpital San Martino, Gênes, Italie) ont été cultivées dans du milieu essentiel minimum d’Eagle (Merck) additionné de 20 % de sérum bovin fœtal (Merck), de L-glutamine 2 mM et d’une solution de pénicilline/streptomycine à 1 % (Merck ) à 5% CO2 et 37°C.
Production pseudoCovid-19 lentivirale
Deux constructions différentes de lentivirus pseudotypés empaquetant la protéine Spike SARS-CoV2 ont été générées via la co-transfection de HEK293T avec les vecteurs suivants : pour la production de lentivirus pseudotypés exprimant la protéine Spike S et la protéine EGFP (EGFP-pseudoCovid-19) a été utilisé incorporant les vecteurs pRP -Protéine S CMV-SARS-CoV2, pLV-Puro-CMV-EGFP (Vector Builder, Chicago, IL, USA) et le plasmide d’encapsidation pCMV Delta R8.2 codant pour Gag-Pol, Tat et Rev (Addgene, MA,. ETATS-UNIS). Pour la production de lentivirus pseudotypés exprimant la protéine Spike S et l’enzyme luciférase (LUC-pseudoCovid-19) tous les vecteurs étaient les mêmes que l’EGFP-pseudoCovid sauf le vecteur pLV-Puro-CMV-EGFP qui a été remplacé par le pLV-Puro – Vecteur EF1A-Luciférase (Vector Builder). Brièvement, des cellules HEK293T (300 000 cellules sur Petri de 6 cm) ont été ensemencées. Après 24 h un mélange de vecteurs lentiviraux (1 µg de pRP-CMV-SARS-CoV2 S, 0,5 µg de pLV-Puro-CMV-EGFP ou pLV-Puro-EF1A-Luciférase, 0,9 µg de pCMV Delta R8.2) a été incubé pendant 20 min dans 400 µl de DMEM contenant 8 µl de réactif de transfection Transit-293 (Mirus, Tema Ricerca, Milan, Italie) et ajouté aux cellules HEK293T en présence de DMEM sans pénicilline-streptomycine pour favoriser la transfection des cellules. 24h après la transfection, le milieu HEK293T a été remplacé par du DMEM complet pour booster la production de pseudoviral. Le surnageant contenant les particules lentivirales a été récolté à 48 h (premier cycle) et 72 h (deuxième cycle) après la transfection, filtré avec un filtre de 0,45 μm de diamètre et purifié selon le protocole décrit dans Kutner, R.H. et al. (18). Brièvement, 12 ml de surnageant ont été déposés sur un coussin contenant 10 % de saccharose dans 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 100 mM de NaCl et 0,5 mM d’EDTA et centrifugés pendant 2 h à 100 000 x g à 4°C. Après centrifugation, le surnageant a été évacué et le culot contenant le pseudovirus a été lavé une fois avec du tampon phosphate salin (PBS) et remis en suspension dans 100 ul de PBS.
Titrage pseudo-Covid-19
Le titrage du pseudoCovid-19 a été effectué afin de déterminer le nombre de particules virales par volume employées dans chaque échantillon de celles utilisées dans les dosages. En bref, la quantité d’unités de transduction par millilitre (TU/ml) présentes dans la préparation de pseudoCovid-19 a été calculée comme le nombre de cellules Caco-2 fluorescentes dans les puits de chaque dilution effectuée et détectée par analyse FACS (Calibur, Beckman Coulter, U.S.A. ). L’UT/ml a été calculée dans les puits où le nombre de cellules fluorescentes était inférieur à 30 % du nombre total de cellules. Les valeurs de TU/ml de chaque dilution ont été moyennées pour obtenir la concentration finale de pseudoCovid19 qui était de 6,9 x 105 TU/ml dans chaque lot produit.
Analyse Western blot.
L’expression de la protéine de pointe Sars-CoV2 sur la construction pseudoCovid-19 générée, après sa production dans des cellules HEK293T transfectées, a été évaluée par analyse Western blot En bref, 30 ml du virus produit et purifié (avec ou sans expression de la protéine Spike S) ont été additionné de 10 ul de la solution tampon de chargement comme décrit précédemment (19) et bouilli 10 min. Ensuite, les échantillons ont été soumis à 8% SDS-PAGE suivi d’un Western blot sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad, Milan, Italie). La protéine Spike S transférée sur la membrane après Western blot a été détectée par un anticorps primaire spécifique dilué au 1:1000 (code #PA5112048, Thermo Scientific, U.S.A). Un conjugué de chèvre anti-IgG de lapin HRP dilué à 1:5000 a été utilisé pour détecter l’anticorps primaire. Le signal de chimioluminescence de l’anticorps secondaire a été acquis par Chemi-Doc System (Bio-Rad) après incubation de la membrane avec le réactif de détection de transfert Western ECL™ (GE-Healthcare Life Sciences, Milan, Italie).
Analyse par microscopie électronique en transmission (TEM) sur le pseudoCovid-19
L’analyse TEM sur des préparations isolées de pseudoCovid-19 lentivirales a été effectuée comme suit. Les préparations pseudovirales ont été remises en suspension dans 20 μL de PBS (pH 7,4) et fixées en ajoutant un volume égal de paraformaldéhyde à 2 % dans du tampon phosphate 0,1 mol/L (pH 7,4). Les pseudo-virus ont ensuite été adsorbés pendant 10 minutes pour former des grilles de cuivre revêtues de var-carbone en faisant flotter les grilles sur des gouttes de 5 μl sur du parafilm. Ensuite, les grilles avec les virus adhérant ont été rincées dans du PBS et colorées négativement avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 5 minutes à température ambiante. Les grilles colorées ont été noyées dans 2,5 % de méthylcellulose pour une meilleure conservation et séchées à l’air avant l’examen. Des micrographies électroniques ont été prises au microscope Hitachi TEM (série HT7800, Tokyo, Japon) équipé d’un appareil photo numérique Megaview 3 et du logiciel Radius (EMSIS, Allemagne).
Test d’infectiosité résiduelle du pseudoCovid-19 en présence d’Enviro-Biotics®
L’interaction entre l’Enviro-Biotics® (BetterAir, Israël), contenant des spores de Bacillus, et le pseudoCovid-19 a été testée à l’aide d’un couvercle de plaque en plastique stérile contenant 96 puits. Les expériences ont été réalisées dans une hotte biologique fermée hermétiquement et éteinte d’un volume intérieur de 0,42 m3 à une température de 25 °C et à 80 % d’humidité relative.
Brièvement, les spores Enviro-Biotics® Bacillus , contenues dans la bombe aérosol commerciale de Betterair, ont été pulvérisées sur les couvercles des puits, jusqu’à atteindre un volume de 30 µl/puits suivi de l’ajout de 10 µl de tampon salin dans chaque puits. Comme témoin négatif, 40 µl de tampon salin ont été ajoutés dans des puits dédiés en l’absence de spores. Les plaques ont été pré-incubées dans une hotte à flux négatif pendant 4 h.
Dans la première expérience, 30 µl d’EGFP-pseudoCovid-19 (contenant environ 20,7 x 103 particules de pseudoCovid-19 selon le titrage effectué) ont été ajoutés à chaque puits, ce qui donne un volume final de 70 µl/puits. Cinq durées d’incubation bactérie-virus différentes ont été testées : 0 min, 15 min, 30 min, 1 h et 3 h en triple exemplaire.
À la fin de chaque point d’incubation, des échantillons ont été prélevés à la surface du puits en plastique, transférés dans un tube de 0,2 ml, centrifugés à 3 500 xɡ pendant 8 minutes et le surnageant récupéré a été filtré (filtre absolu de 0,2 µm) pour éliminer tout débris bactérien.
Immédiatement après la filtration, le surnageant récupéré de chaque échantillon a été transféré dans des plaques 96 puits où des cellules Caco-2 ont été ensemencées (15 000 cellules/puits, ensemencées 24 heures avant la stimulation). Les cellules Caco-2 ont été incubées avec le surnageant récupéré pendant 72 h ; à la fin de cette incubation, les cellules Caco-2 (dérivant de chaque point de temps expérimental différent) ont été mesurées pour leur fluorescence par spectrofluorimètre (BMG Labtech, Clario starplus) pour quantifier l’infectivité résiduelle de l’EGFP-pseudoCovid-19 après son incubation ou pas avec Enviro-Biotics®. Après cette détection fluorimétrique, sur les mêmes cellules a été réalisée une acquisition d’analyse qualitative par microscopie confocale à fluorescence.Qualitative fluorescence confocal microscopy of infected Caco-2 cells
After 72 h of incubation of Caco-2 cells (15,000 cells/well seeded in a 96-well plate) with the supernatants deriving from the time 0 and time three h of the residual infectivity test with EGFP- Covid-19 in the presence or not of Enviro-Biotics®, qualitative images were obtained with a fluorescence confocal microscope.
Un deuxième test d’inactivation sur l’infectiosité du pseudoCovid-19 en présence des Enviro-Biotics® a été réalisé en utilisant le LUC-pseudoCovid-19 (au lieu de l’EGFP-pseudoCovid-19) afin de valider l’efficacité virucide de Bacillus avec un système de détection différent . Toutes les conditions expérimentales étaient identiques à l’expérience EGFP-pseudoCovid-19 sauf pour (1) le temps d’incubation sur les cellules Caco-2 avec les surnageants récupérés qui a duré 120 h et (2) l’évaluation de l’infectiosité résiduelle sur les cellules qui a été quantifié par acquisition de chimiluminescence comme activité luciférase (BMG Labtech, Clario starplus).Microscopie confocale à fluorescence qualitative de cellules Caco-2 infectées Après 72 h d’incubation des cellules Caco-2 (15 000 cellules/puits ensemencées en plaque 96 puits) avec les surnageants issus du temps 0 et du temps 3 h du test d’infectiosité résiduelle avec EGFP-pseudoCovid-19 en présence ou non d’Enviro-Biotics®, des images qualitatives ont été obtenues avec un microscope confocal à fluorescence.
Test de formation de colonies
Le test de formation de colonies a été effectué sur les mêmes cellules Caco-2 incubées pendant 72 h avec les surnageants récupérés par l’expérience d’inactivation EGFP-pseudoCovid-19 après l’acquisition fluorimétrique de l’infectivité virale résiduelle. En bref, 2 mg/ml de puromycine (Merck, U.S.A.) ont été ajoutés toutes les 48 h pendant 12 jours aux cellules Caco-2. Après 12 jours, les colonies ont été colorées avec un cristal violet à 0,5 %.
solution. La différence de quantité de colonies entre les échantillons a été détectée en dissolvant le colorant avec une solution de SDS à 2 % et quantifiée par absorbance spectrophotométrique à 570 nm.
Inactivation du pseudoCovid-19.
Le nombre de bactéries actives dérivant des spores Enviro-Biotics utilisées dans les expériences d’inactivation du pseudoCovid-19, a été calculé en réalisant une croissance bactérienne de colonies sur milieu solide Agar (agar 15g/L, extrait de levure 2 g/L, 2 g /L de poudre de lait écrémé, 16 g/L de glucose, 5 g/L de chlorure de sodium). Brièvement, le point d’incubation au temps zéro de l’expérience pour évaluer l’inactivation du pseudoCovid-19 a été centrifugé à 3 500xg pendant 8 min et le culot, contenant les bactéries, a été remis en suspension dans 200 ul de PBS (suspension de stock de bactéries). Des dilutions en série ont été réalisées à partir de la suspension mère de bactéries (1:100, 1:10 000 et 1:1 000 000) et 250 mL de chaque dilution ont été étalés en double sur une boîte de Pétri contenant du milieu gélosé solide (composition : gélose 15 g/L + 2 g /L d’extrait de levure, 2 g/L de poudre de lait écrémé, 16 g/L de glucose, 5 g/L de chlorure de sodium). Une boîte de Pétri avec le milieu gélosé seul a été utilisée comme témoin. Après une nuit d’incubation à 37°C, les colonies ont été comptées. Le comptage des colonies n’était possible qu’à la dilution 1:1 000 000 où chaque colonie était bien séparée d’une autre dans toute la surface de Pétri. La quantité moyenne finale de bactéries a été calculée en UFC/mL.
RÉSULTATS
Confirmation de l’expression de la protéine S pseudoCovid-19 et caractérisation virale.
L’expression de la protéine S du SRAS-CoV2 sur les pseudovirus générés après la transfection des cellules HEK293T a été confirmée par analyse Western blot sur des lysats de virus produits et purifiés. Comme le montre la Fig. 1, le pseudoCovid-19 produit exprimait la protéine S typique du SRAS- naturel CoV2 qui a été entièrement reconnu avec l’anticorps spécifique anti-protéine Spike. L’analyse par microscopie électronique à transmission (TEM) sur les pseudovirus générés, exprimant tous deux EGFP et LUC, a confirmé que la taille des particules pseudovirales était similaire à celle du virus naturel SARS-CoV2 (20) et que le pseudoCovid-19 obtenu à partir de la cellule HEK293T la transfection était intacte (Fig. 2).
Résultats de titrage
Un titrage viral a été réalisé pour quantifier la concentration de particules virales dans les préparations utilisées dans toutes les expériences. La concentration de particules virales a été exprimée en unités de transduction par millilitre (TU/ml). FACS a analysé les cellules caCo-2 transduites avec des dilutions doubles d’EGFP-Covid-19 pour détecter le nombre de cellules fluorescentes dans les puits de chaque dilution. Le TU/ml a été calculé dans les puits où le nombre de cellules fluorescentes était inférieur à 30 % du total (Fig. 3). Le TU/ml donnait 6,9 x 105, donc à chaque point expérimental, le nombre de particules virales était de 20,7 x 103.
Inactivation du Covid-19 par les cellules Bacillus Enviro-Biotics®
La suspension de spores Enviro-Biotics® Bacillus a été appliquée sur la surface testée quatre heures avant l’inoculation virale. Les concentrations de cellules Bacillus pulvérisées sur la surface testée, après 4 heures de pré-incubation et avant l’ajout du Covid-19, ont été comptées, ce qui donne une valeur moyenne de 1,42 x 108 UFC/ml pour chaque instant d’incubation (données non présentées).
Log10 de la fluorescence mesurée dans l’échantillon où le virus était en présence des spores était de 0,5 et 1,6 en présence d’EGFP-Covid-19 à 15 min et trois h, respectivement (tableau 1A). Une acquisition qualitative en microscopie confocale à fluorescence a confirmé l’inactivation presque complète du virus en 3 h (Fig. 5). De plus, après détection spectrofluorimétrique, l’ajout de puromycine à chaque puits des cellules hôtes Caco-2 en ce qui concerne la formation de colonies a permis d’évaluer l’efficacité virucide médiée par les cellules de Bacillus. Comme le montre la figure 6, les cellules traitées avec les surnageants dérivés des incubations où le Covid-19 a été incubé en présence de cellules Bacillus ont fortement diminué la formation et la survie de colonies infectées par le Covid-19. En effet, la quantification du cristal violet par absorbance spectrophotométrique à 570 nm des cristaux dissous, correspondant aux colonies formées dans le test de formation de colonies (Fig. 7), était conforme aux valeurs de fluorescence, représentant l’inactivation du virus rapportées dans la figure 4.
Une confirmation supplémentaire de l’efficacité antivirale de Bacillus contenant Enviro-Biotics® a été obtenue en stimulant les cellules Caco-2 avec une construction Covid-19 différente dans laquelle un LUC a remplacé l’EGFP. Semblable à l’expérience qui a démontré l’inactivation de l’EGFP-Covid-19, les cellules infectées par LUC-Covid-19 se sont également révélées sensibles aux cellules contenant des bacilles Enviro-Biotics®. Le % d’inactivation médiée par les spores Enviro-Biotics® Bacillus , lorsqu’elle est détectée par acquisition par chimiluminescence, était de 70 % après 15 minutes d’incubation et d’environ 99 % après trois heures (Fig. 8 ; Tableau 1B), pratiquement les mêmes résultats obtenus avec l’EGFP. -études de constructions virales. De plus, la réduction log calculée à 15 minutes et à trois heures était respectivement de 0,8 et 1,85 (tableau 1B). Les résultats obtenus dans ces études alternatives sur les constructions virales LUC ont confirmé l’efficacité des effets d’inactivation d’Enviro-Biotics® observés dans les études sur les constructions virales EGFP, fournissant ainsi un soutien supplémentaire à l’utilisation d’Enviro-Biotics comme modalité antivirale par deux approches particulièrement différentes.
Discussion
Les présentes études démontrent qu’Enviro-Biotics® peut offrir une protection contre le covid-19.
Ceci est important car les moyens actuels de réduire la transmission et l’infectiosité du virus Covid-19, notamment la distanciation sociale, le masquage et le lavage des mains, ne sont pas totalement efficaces ni universellement utilisés. À cette fin, l’incorporation d’Enviro-Biotics® peut constituer un moyen de protection supplémentaire et nécessaire dans l’arsenal pour réduire la transmission virale.
Les caractéristiques Enviro-Biotics® importantes suivantes se distinguent par le fait qu’ils (1) sont des bacilles stables et sporulés qui peuvent être conservés dans une variété de conteneurs sans prêter attention aux températures particulières et/ou aux conditions d’expédition et de manipulation des matières dangereuses, ce qui les rend universels. disponible par rapport à de nombreuses compositions détergentes chimiques qui nécessitent des permis, des équipements de protection individuelle ou des installations spéciales, (2) peut être distribuée par aérosol sur la majorité des surfaces. Ceci peut être étendu par pulvérisation dans des environnements sélectionnés qui peuvent être sujets à la propagation des infections à travers des espaces clos (automobiles, chambres d’hôtel), ou par une distribution dosée via des unités programmables (salles de concert, bouches de chauffage/refroidissement domestique), (3) peut être distribué via l’aérosolisation qui fournira une couverture de surface plus efficace que les mousses et les liquides conventionnels lorsqu’il s’agit de surfaces inégales telles que celles contenant des pores, des fissures ou des espaces, (4) peut rivaliser activement avec les organismes infectieux lorsqu’ils sont présents et rester en sommeil lorsque les agents infectieux ne constituent plus une menace, seulement pour se repeupler lorsqu’une nouvelle menace infectieuse se présente.
Une telle méthode serait rentable, durable, repeuplable, respectueuse de l’environnement et favoriserait la longévité des effets protecteurs, offrant ainsi un avantage unique au marché des soins de santé par rapport aux interventions conventionnelles.
Diverses études ont démontré les effets bénéfiques d’Enviro-Biotics®. LaFauci et ses collègues (14) ont utilisé des Enviro-Biotics® contenant diverses espèces de Bacillus (c’est-à-dire B. subtilis, B. pumilus, B. megaterium) dans leur système d’hygiène de nettoyage probiotique (PCHS). Dans ces études, les surfaces (lavabo, sol et bureau) ont été ensemencées d’organismes infectieux, puis désinfectées avec Enviro-Biotics® et évaluées pour la recontamination. L’ajout d’Enviro-Biotics® a réduit les organismes liés à l’HIA (S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, A. baumannii, E. faecalis et C. albicans) de plus de 92 % après 24 h. De plus, des essais sur le terrain pour évaluer l’efficacité des probiotiques pour contenir les agents pathogènes dans un environnement hospitalier standard (personnel, patients, famille), a également démontré l’élimination des bactéries pathogènes après seulement six heures, même en cas de recontamination. Cela démontre en outre la durabilité de l’application d’Enviro-Biotics® dans le temps, ce qui serait dû à la stabilisation des biofilms qui continuent de contenir et de réduire la prolifération des micro-organismes pathogènes (21). Des études de Vandini et ses collègues (22) ont montré que l’application d’une solution Enviro-Biotics® contenant des Bacillus en milieu hospitalier réduisait la charge microbienne de S. aureus, coliformes, Pseudomonas spp. et Candida spp., plus de 80 % et a maintenu l’effet antimicrobien pendant cinq jours.
Malgré les effets bénéfiques rapportés d’Enviro-Biotics® et le fait que les espèces de Bacillus sont généralement reconnues comme sûres (GRAS) par la FDA (23), la question de savoir si ces applications sont sans danger pour les humains en milieu clinique ne peut être ignorée. . À cette fin, Caselli et ses collègues
(15) ont étudié l’impact d’un nettoyant à base de bacilles Enviro-Biotics® sur les agents pathogènes dans un établissement de soins de santé. De plus, ils ont évalué la capacité des bacilles dérivés du nettoyant Enviro-Biotics® à infecter les patients hospitalisés. Non seulement ils ont signalé une diminution des gènes de résistance aux antibiotiques dans la population microbienne contaminante, mais les auteurs ont également constaté que les patients positifs pour les HAI dans ces études étaient négatifs pour les bacilles, ce qui suggère qu’ils peuvent être utilisés en toute sécurité pour réduire les agents pathogènes. De plus, leur intervention PCHS Enviro-Biotics® a montré une diminution de 33 à 100 % des souches résistantes aux antibiotiques, une diminution de 60 % de la consommation de médicaments antimicrobiens contre les HAI et une réduction de 75 % des coûts associés aux maladies (15). Tarricone et ses collègues (13) ont également rapporté que l’utilisation d’Enviro-Biotics® au lieu de nettoyants conventionnels permettrait d’éviter 31 000 IAS et 8 500 résistances aux antibiotiques sur cinq ans et de réduire les coûts de 14 millions d’euros (16,8 millions de dollars américains), dont plus de 80 %. les coûts concernent le traitement des IAS résistantes. De même, des rapports récents de Kim et al (24) ont montré les effets bénéfiques d’Enviro-Biotics® dans des modèles d’asthme animal en évaluant la sécurité, l’efficacité antimicrobienne et l’activité contre les agents pathogènes aéroportés. Dans ces études, l’instillation intranasale et l’inhalation d’Enviro-Biotics® (B. subtilis et 1. amyloliquefaciens) dans un modèle murin d’inflammation pulmonaire induite par l’ovalbumine (OVA) ont réduit les cytokines T auxiliaires de type 2 (Th2) aux niveaux transcriptionnel et protéique. Enviro-Biotics® a diminué l’expression de l’ARNm de l’IL-4 et de l’IL-5 et/ou les niveaux de protéines sans altérer l’IL-10 dans l’inflammation pulmonaire induite par l’OVA in vivo, soulignant ainsi leurs effets immunomodulateurs. Les métabolites des espèces de Bacillus, notamment le 2,3-butanediol, le propylène glycol, l’acide malonique, l’acide 2-méthylbutyrique, l’acide lactique, la subtilosine et l’acide aconitique, ont été identifiés comme agents antifongiques antimicrobiens possibles, agissant individuellement et/ou via des effets additifs et synergiques. pour médier les processus inhibiteurs observés. L’application d’Enviro-Biotics® ne se limite pas aux laboratoires et aux établissements de soins de santé. Les bâtiments sujets à la croissance de bactéries ou de moisissures et souffrant du syndrome des bâtiments malades (25) peuvent coûter des centaines de milliers de dollars pour être réparés par des entrepreneurs conventionnels ou être sujets à démolition. De plus, les immeubles de bureaux et les systèmes scolaires peuvent bénéficier d’Enviro-Biotics® pour maintenir un environnement de travail hygiéniquement stable, diminuer la transmission de maladies infectieuses et réduire les journées de travail ou d’école perdues ainsi que les expériences litigieuses résultant de préjudices sur le lieu de travail (26-28).
L’application d’Enviro-Biotics® dans les infections virales a également été rapportée. Hong et collègues
ont étudié les effets de l’administration intranasale de Bacillus subtilis contenant Enviro-Biotics® dans un modèle murin de RSV. Ils ont découvert que l’administration d’Enviro-Biotics® induisait l’expansion des macrophages alvéolaires en plus de l’activation et de la production accrue de cytokines inflammatoires, de la différenciation des macrophages et d’une réduction profonde des titres viraux et des lésions pulmonaires liées au VRS, suggérant son utilisation comme approche thérapeutique potentielle contre le VRS.
Nos études ont examiné l’effet des espèces de Bacillus contenant Enviro-Biotics® sur l’infectiosité des coronavirus. Nous avons utilisé un coronavirus qui exprime la protéine de pointe du coronavirus de type sauvage unique au CoV2. Ce virus a été utilisé pour infecter les cellules Caco-2 qui contiennent le récepteur ACE2
en présence et en absence d’Enviro-Biotics®. Nous avons constaté qu’Enviro-Biotics® réduisait l’infectivité des covid > 97 % après trois heures en utilisant à la fois les constructions rapporteurs GFP et LUC et que la formation de colonies induite par la puromycine était également réduite dans le groupe de traitement. Ces résultats concordent avec d’autres études qui ont évalué l’effet d’Enviro-Biotics® dans d’autres infections virales.
y compris les systèmes CoV du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV) ou du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) (17). Dans ces études, les composants peptidoglycanes (PG) de
1. subtilis a réduit l’infection de plus de 10 000 fois, contrairement aux PG provenant d’autres espèces bactériennes. Les auteurs ont identifié un lipopeptide cyclique – la surfactine – qui était responsable des effets antiviraux observés et que le traitement à la surfactine était efficace contre de nombreux virus enveloppés in vitro, notamment le virus de la grippe A (souches H1N1 et H3N2), Zika, Dugbe, Nipah, Crimean. -Fièvre hémorragique du Congo, Chikungunya, Una, Mayaro et Ebola. Collectivement, ces résultats mettent en évidence les effets antiviraux remarquables d’Enviro-Biotics® et leur potentiel à avoir un impact sur la pathogenèse virale.
CONCLUSION
Enviro-Biotics® représente une application probiotique environnementale émergente pour la réduction des organismes infectieux. Les résultats rapportés ici indiquent l’activité antivirale significative des espèces de Bacillus contenant Enviro-Biotics® sur une construction d’infection virale Covid-19, ayant une homologie complète avec le virus naturel du SRAS-CoV-2, et la quasi-éradication du pouvoir infectieux en peu de temps. . Ces résultats, en conjonction avec les effets bénéfiques précédemment rapportés sur divers systèmes de transmission de maladies, édifient davantage l’utilisation potentielle d’Enviro-Biotics® comme nouvelle intervention pour réduire l’infection par le SRAS-CoV2.
Les références
Tirupathi R, Bharathidasan K, Palabindala V, Salim SA, Al-Tawfiq JA. Comprehensive review of mask utility and challenges during the COVID-19 pandemic. Infez Med. 2020 Jun 1;28(suppl 1):57-63. PMID:
- Regli A, Sommerfield A, von Ungern-Sternberg BS. The role of fit testing N95/FFP2/FFP3 masks: a narrative review. Anaesthesia. 2021 Jan;76(1):91-100. doi: 10.1111/anae.15261. Epub 2020 Sep 15. PMID:
- Primov-Fever A, Amir O, Roziner I, Maoz-Segal R, Alon EE, Yakirevitch A. How face masks influence the sinonasal quality of life during the COVID-19 pandemic. Eur Arch
Otorhinolaryngol. 2021 Mar 27:1–7. doi: 10.1007/s00405-021-06752-2. Epub ahead of print. PMID: 33772607; PMCID: PMC7998091.
- Hopkins SR, Dominelli PB, Davis CK, Guenette JA, Luks AM, Molgat-Seon Y, Sá RC, Sheel AW, Swenson ER, Stickland MK. Face Masks and the Cardiorespiratory Response to Physical Activity in Health and Disease. Ann Am Thorac Soc. 2021 Mar;18(3):399-407. doi: 10.1513/AnnalsATS.202008-990CME. PMID: 33196294; PMCID:
- Roberge R. Facemask use by children during infectious disease outbreaks. Biosecur Bioterror. 2011 Sep;9(3):225-31. doi: 10.1089/bsp.2011.0009. Epub 2011 Aug 15. PMID:
- Esposito S, Principi N. To mask or not to mask children to overcome COVID-19. Eur J Pediatr. 2020 Aug;179(8):1267-1270. doi: 10.1007/s00431-020-03674-9. Epub 2020 May PMID: 32388722; PMCID: PMC7210459.
- Shimabukuro PMS, Duarte ML, Imoto AM, Atallah ÁN, Franco ESB, Peccin MS, Taminato
- Environmental cleaning to prevent COVID-19 infection. A rapid systematic review. Sao Paulo Med J. 2020 Nov-Dec;138(6):505-514. doi: 10.1590/1516-3180.2020.0417.09092020. PMID: 33206913.
- Anderson DE, Sivalingam V, Kang AEZ, Ananthanarayanan A, Arumugam H, Jenkins TM, Hadjiat Y, Eggers M. Povidone-Iodine Demonstrates Rapid In Vitro Virucidal Activity Against SARS-CoV-2, The Virus Causing COVID-19 Disease. Infect Dis Ther. 2020 Sep;9(3):669-675. doi: 10.1007/s40121-020-00316-3. Epub 2020 Jul 8. PMID: 32643111; PMCID:
- Dumas O, Varraso R, Boggs KM, Quinot C, Zock JP, Henneberger PK, Speizer FE, Le Moual N, Camargo CA Jr. Association of Occupational Exposure to Disinfectants With Incidence of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Among US Female Nurses. JAMA Netw Open. 2019 Oct 2;2(10):e1913563. doi: 10.1001/jamanetworkopen.2019.13563. PMID: 31626315; PMCID:
- Ernstgård L, Sjögren B, Johanson G. Acute effects of exposure to vapors of hydrogen peroxide in humans. Toxicol Lett. 2012 Jul 20;212(2):222-7. doi: 10.1016/j.toxlet.2012.05.025. Epub 2012 Jun 5. PMID:
- Tan SW, Oh CC. Contact Dermatitis from Hand Hygiene Practices in the COVID-19 Pandemic. Ann Acad Med Singap. 2020 Sep;49(9):674-676. PMID:
- Alluhayyan OB, Alshahri BK, Farhat AM, Alsugair S, Siddiqui JJ, Alghabawy K, AlQefari GB, Alolayan WO, Abu Hashem IA. Occupational-Related Contact Dermatitis: Prevalence and Risk Factors Among Healthcare Workers in the Al’Qassim Region, Saudi Arabia During
the COVID-19 Pandemic. Cureus. 2020 Oct 15;12(10):e10975. doi: 10.7759/cureus.10975. PMID: 33209532; PMCID: PMC7667620.
- Tarricone R, Rognoni C, Arnoldo L, Mazzacane S, Caselli E. A Probiotic-Based Sanitation System for the Reduction of Healthcare Associated Infections and Antimicrobial Resistances: A Budget Impact Analysis. Pathogens. 2020 Jun 23;9(6):502. doi: 10.3390/pathogens9060502. PMID: 32585922; PMCID:
- Fauci, Vincenza La (2015). “An Innovative Approach to Hospital Sanitization Using Probiotics: In Vitro and Field Trials”. Journal of Microbial & Biochemical Technology (1948-5948), 07 (03).
- Caselli E, Brusaferro S, Coccagna M, Arnoldo L, Berloco F, Antonioli P, Tarricone R, Pelissero G, Nola S, La Fauci V, Conte A, Tognon L, Villone G, Trua N, Mazzacane S; SAN-ICA Study Group. Reducing healthcare-associated infections incidence by a probiotic- based sanitation system: A multicentre, prospective, intervention study. PLoS One. 2018 Jul 12;13(7):e0199616. doi: 10.1371/journal.pone.0199616. PMID: 30001345; PMCID: PMC6042698.
- Hong JE, Kye YC, Park SM, Cheon IS, Chu H, Park BC, Park YM, Chang J, Cho JH, Song MK, Han SH, Yun CH. Alveolar Macrophages Treated With Bacillus subtilis Spore Protect Mice Infected With Respiratory Syncytial Virus A2. Front Microbiol. 2019 Mar 12;10:447. doi: 10.3389/fmicb.2019.00447. PMID: 30930867; PMCID:
- Johnson BA, Hage A, Kalveram B, Mears M, Plante JA, Rodriguez SE, Ding Z, Luo X, Bente D, Bradrick SS, Freiberg AN, Popov V, Rajsbaum R, Rossi S, Russell WK, Menachery VD. Peptidoglycan-Associated Cyclic Lipopeptide Disrupts Viral Infectivity. J Virol. 2019 Oct 29;93(22):e01282-19. doi: 10.1128/JVI.01282-19. PMID: 31462558; PMCID:
- Kutner RH, Zhang XY, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22. PMID:
- LAEMMLI, U. K. (08/1970). “Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4”. Nature (London) (0028-0836), 227 (5259), p.
- Brahim Belhaouari, Djamal (08/2020). “The Strengths of Scanning Electron Microscopy in Deciphering SARS-CoV-2 Infectious Cycle”. Frontiers in microbiology (1664-302X), 11 .
- Lakshmanan V, Bais HP. Factors other than root secreted malic acid that contributes toward Bacillus subtilis FB17 colonization on Arabidopsis roots. Plant Signal Behav. 2013 Nov;8(11):e27277. doi: 10.4161/psb.27277. Epub 2013 Dec 5. PMID: 24310121; PMCID: PMC4092310.
- Mazzacane, Sante (10/2014). “Reduction of the Microbiological Load on Hospital Surfaces Through Probiotic-Based Cleaning Procedures: A New Strategy to Control Nosocomial Infections”. Journal of Microbiology & Experimentation (2373-437X), 1 (5).
- Lee NK, Kim WS, Paik HD. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food Sci Biotechnol. 2019 Oct 8;28(5):1297-1305. doi: 10.1007/s10068-019-00691-9. PMID: 31695928; PMCID: PMC6811671.
- Kim, Hye‐Shin (06/2021). “Assessment of the safety and anti‐inflammatory effects of three Bacillus strains in the respiratory tract”. Environmental microbiology (1462-2912), 23 (6), p. 3077.
- Redlich CA, Sparer J, Cullen MR. Sick-building syndrome. Lancet. 1997 Apr 5;349(9057):1013-6. doi: 10.1016/S0140-6736(96)07220-0. PMID:
- Ketema RM, Araki A, Ait Bamai Y, Saito T, Kishi R. Lifestyle behaviors and home and school environment in association with sick building syndrome among elementary school children: a cross-sectional study. Environ Health Prev Med. 2020 Jul 11;25(1):28. doi: 10.1186/s12199-020-00869-2. PMID: 32652952; PMCID: PMC7354679.
- Abbritti G, Muzi G. Indoor air quality and health in offices and other non-industrial working environments. Med Lav. 2006 Mar-Apr;97(2):410-7. PMID: 17017378.
- Seppänen OA, Fisk WJ. Summary of human responses to ventilation. Indoor Air. 2004;14 Suppl 7:102-18. doi: 10.1111/j.1600-0668.2004.00279.x. PMID:
- Hong JE, Kye YC, Park SM, Cheon IS, Chu H, Park BC, Park YM, Chang J, Cho JH, Song MK, Han SH, Yun CH. Alveolar Macrophages Treated With Bacillus subtilis Spore Protect Mice Infected With Respiratory Syncytial Virus A2. Front Microbiol. 2019 Mar 12;10:447. doi: 10.3389/fmicb.2019.00447. PMID: 30930867; PMCID:
- Mossel EC, Huang C, Narayanan K, Makino S, Tesh RB, Peters CJ. Exogenous ACE2 expression allows refractory cell lines to support severe acute respiratory syndrome coronavirus replication. J Virol. 2005 Mar;79(6):3846-50. doi: 10.1128/JVI.79.6.3846- 3850.2005. PMID: 15731278; PMCID:
Fig. 1
Fig. 1 A representative Western blot analysis, performed as described in Methods, on lysates of virus expressing or not the Spike S protein of Covid-19 used for all the tests. The Spike S was identified using a specific mAb (Thermo Scientific, U.S.A) protein on the lysate viruses samples.
Fig. 2
Fig. 2 A representative image of TEM acquisition of the produced Covid-19 (magnification 50000x; 100 Kv). Red arrows indicate the viral particles in the field of acquisition; the yellow box is a zoom image of a single viral particle. The table summarizes the 2D dimension of Covid-19.
Fig.3
Fig. 3. FACS analysis of EGFP-Covid-19 titration. In panels A-C, a representative sample of non-transduced cells shows the cells totally negative for the presence of green fluorescence. In panels D-E, a representative sample of transduced cells with EGFP-Covid-19 shows a percentage of cells positive for green fluorescence.
Fig. 4
Fig. 4. Fluorimetric quantitation of EGFP-Covid-19 residual infectivity on Caco-2 cells detected as GFP fluorescence presented as Relative Fluorescence Units (RFU), as described in Methods. The background of auto-fluorescence deriving from untreated Caco-2 cells was subtracted for each experimental time point. Each bar is the mean±SD of a triplicate. P value was calculated by unpaired t-Test. ***p< 0.001
Fig. 5
Fig. 5. Fluorescence confocal microscope images (20X magnification) of Caco2 cells incubated for 72 h with the recovered supernatant of EGFP-Covid-19 test at time 0 (T0) and time three h (T3). Panels on the left represent the controls (supernatant of EGFP-Covid-19 alone); panels on the right represent the fluorescence of Caco-2 cells treated with the supernatants of EGFP-Covid-19 incubated with Enviro- Biotic® at T0 (Initiation of Bacillus–virus incubation) and at T3 of the residual infectivity test.
Fig. 6
Fig. 6. Colony forming assay, as described in Methods, of Caco-2 cells incubated for 12 days with the supernatants of the different time point incubations deriving from the EGFP-Covid-19 residual infectivity test. Upper lane: cells incubated with the supernatants of Covid-19 alone; lower lane: cells incubated with the supernatants of Covid-19 treated in the presence of Enviro-Biotics®.
Fig. 7
Fig. 7. Crystal violet quantitation by spectrophotometric absorbance at 570 nm of the dissolved crystals corresponding to the colonies formed in the colony forming assay. Black bars: control (EGFP-Covid- 19 alone); white bars: EGFP-Covid-19 incubated with Enviro-Biotics®
Fig. 8
Fig. 8. Chemiluminescence quantitation of the LUC-Covid-19 residual infectivity detected as luciferase activity, presented as Relative Luciferase Units (RLU). Each bar is the mean±SD of a triplicate. P value was calculated by unpaired t-Test; ***p< 0.001
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